雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒

      螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過程中，會發出生物熒光(Bioluminescence)。海腎熒光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的過程中也會發出生物熒光。生物熒光可以通過化學發光儀(Luminometer)或液閃測定儀進行測定。

　　在 DLR 檢測中，螢火蟲（Firefly）熒光素酶和海腎（Renilla）熒光素酶的活性可在單個樣品中依次檢測。先是先以熒光素(Luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)，后以腸腔素(Coelenterazine)為底物來檢測海腎熒光素酶(Renilla Luciferase)，并在后續加入海腎熒光素酶底物時，同時加入抑制螢火蟲熒光素酶催化Luciferin發光的物質，使后續檢測僅僅檢測到海腎熒光素酶的活性，實現雙熒光素酶報告基因檢測。通過熒光素酶和其底物這一生物發光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把感興趣基因的轉錄調控元件或5' 啟動子區克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 區克隆在Luciferase 的下游等，構建成報告基因(Reporter Gene)質粒，然后轉染細胞，用適當藥物等處理細胞后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因的轉錄調控作用。 Renilla Luciferase 相對更多地被用作轉染效率的內參，以消除細胞數量和轉染效率的差異。

　　具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無細胞內源活性干擾等特點。

訂購信息

試劑盒組分

保存方法

藍冰運輸。-20℃保存，有效期12個月。

【注】：C組分建議預先使用B組分配制為2 mg/mL儲液，B組分、D組分及配制為儲液的C組分，根據實驗需求進行小批量分裝。所有檢測工作液建議現配現用，避免反復凍融。

使用方法
1.細胞裂解
（1）將轉入報告基因的細胞中的培養基移除，加PBS 輕輕洗滌兩次（貼壁細胞可直接進行此操作，懸浮細胞要離心收集細胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer (用無菌水按 4:1 稀             釋 A 組分)， 然后將培養板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min，充分裂解細胞。

 注：裂解產物可室溫保存 6 h，-70℃可長期存放（裂解產物不能多次反復凍融）。如果熒光素酶的表達水平比較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以小為  100μL。

（2）將充分裂解后的裂解產物，10000-15000 rpm 離心 3-5 min。離心后將上清液移入新的 EP 管中進行后續檢測。

（3）細胞裂解后可以立即測定熒光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定。

2. 工作液配制

（1）用B 組分充分溶解C 組分，配制成0.2 mg/mL的螢火蟲熒光素酶檢測液。

注：螢火蟲熒光素酶工作液不能反復凍融，若單次實驗用量較少，建議按單次使用量分裝成小規格。

（2）用D組分將E組分稀釋成1× Coelenterazine工作液，稀釋方法為將1 µL E組分加入到49 µL D組分中，此稀釋方法可按比例相應擴大。

注：1× Coelenterazine工作液應該現用現配。
3. 化學發光值檢測

（1）將上述配制好的螢火蟲熒光素檢測液和1× Coelenterazine工作液恢復至室溫。

（2）按儀器操作說明書開啟化學發光儀或具有檢測化學發光功能的多功能酶標儀，將測定間隔設為2 s，測定時間設為10 s。

（3）每個樣品測定時，取樣品20-100μL(如果樣品量足夠，請加入100μL；如果樣品量不足可以適當減少用量，但同批樣品的使用量宜保持一致)。

（4）加入100μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑，用槍打勻或用其它適當方式混勻后測定RLU(relative light unit)。以報告基因細胞裂解液為空白對照。

注：由于該發光為瞬時發光，建議加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑后，立即進行發光值的檢測。

（5）在完成上述測定螢火蟲熒光素酶步驟后，加入 100 μL海腎熒光素酶檢測工作液，用槍打勻或用其它適當方式混勻后測定RLU(relative light unit)。

（6）在以海腎熒光素酶為內參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎熒光素酶測定得到的 RLU 值。根據得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲熒光素酶為內參，也可以進行類似計算。

注意事項
1. 為取得理想測定效果，在用單管的化學發光儀測定時，樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應盡量控制一致；使用具有化學發光測定功能的多功能熒光酶標儀時，宜先把樣品全部加好，然后統一加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑。

2. 由于溫度對酶反應有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。