Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒

產品描述
　　Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒，本試劑盒采用一對支原體特異性引物，用于對樣品的支原體基因組DNA進行PCR擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。試劑盒內同時含有內參對照，用于監控PCR是否正常擴增。

　　本試劑盒與MB Zell Shield 13-0050等產品相比更具優勢，替代性強，具體情況可詳見下文或咨詢銷售人員。
　　本試劑盒是一種廣譜的支原體檢測試劑盒，可以識別所有100多種至今已發現的支原體；能用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：體外細胞培養的上清；血清；各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；其他液體樣品等。具有100%支原體識別率、靈敏度*、含內參條帶從而可以區分真陰性樣品和假陰性樣品、無需配套相對昂貴的熒光定量PCR儀等優點。
　　經多次測試，本試劑盒有記錄可以識別在體外細胞培養中曾經報道出現的20種支原體，根據文獻報道，這些支原體基本能占污染細胞的支原體種類的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、（14）M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫; A.為Acholeplasma的縮寫）。

訂購信息

【注】：
以下試劑需要自行準備：①普通的Taq DNA 聚合酶（推薦使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version，貨號：RR006A，已包含2.5 mM 的 dNTP）和相應的緩沖液；② 2.5 mM的dNTP；③DNA上樣緩沖液（推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號：AN34L047，該緩沖液已含無毒核酸染料，不需要接觸 EB 等致癌物質）。
運輸與保存條件
　　冰袋運輸，-20℃保存，可以保存五年。
使用方法
1.待測樣品的準備
取換液后培養2-3 d且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞在換液傳代后，生長2-3 d再取培養液進行檢測?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進行樣品的前處理：
方法一
（1）取 150μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm 低速離心5 min；
（2）上述離心上清液，95 ℃加熱處理5 min（可以轉移到 PCR 管內，在 PCR 儀上進行加熱處理），簡單離心（1000g，5 s）后，取上清進行檢測。
方法二（推薦本方法，有高速離心機的的可選用本方法，可以去PCR抑制物，準確性更高。）
（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，普通臺式離心機1000 rpm 離心5 min，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。
（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸走全部上清，用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5（推薦使用，樣品可以長期保存）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸、沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻。
（3）該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理 5 min（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000g，5 s）后，取上清進行檢測。
【注】：
① 這里的細胞培養上清不是指細胞經*酶消化后的離心上清，而是指至少培養 2 d后的貼壁細胞培養液上清或懸浮細胞培養液；
② 本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會；
③ 收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存；
④ 如果預期待測樣品支原體含量較少（比如低溫保存的血清、臍帶血、*mei、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取措施以提高檢測的靈敏度，具體方法請看后文注意事項部分：如何提高本試劑盒檢測靈敏度。
2.PCR 體系的配制  
（1）按照25μL體系配制比例如下。如果是多樣品檢測，加兩個對照樣品后各組分總體積如下表。配制好的混合液，按每管23μL分裝到0.2 mL的PCR管中。

【注】：
① 總體積中多配制 6% 是為了防止移液導致誤差，以保證每個反應管中的反應液足量；
② 如果有條件，PCR 體系的配制建議在冰上進行操作；
③ 本試劑盒不推薦使用 2× 的 PCR mixture（內含 Taq 酶、緩沖液和 dNTP），建議使用Taq酶、10×Taq 緩沖液和 dNTP 等試劑配制PCR體系；
④ 為了避免可能的污染，收到的支原體引物和內參，可以適當分裝（比如：每支 40μL）后冷凍保存；
⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶（前提是：陰性對照的 586 bp 內參條帶必須有一定亮度，且穩定性良好，否則不能使用），酶、去離子水的加入量需要根據其說明書進行調整。
（2）加入待測樣品、陰性和陽性對照樣品。樣品檢測管中加入2μL待測樣品，陰性對照管加入2μL去離子水，陽性對照管加入2μL陽性支原體 DNA。
【注】：
① 裝有陽性支原體 DNA 的螺口管開蓋之前，低速離心或用手指捏住，用力甩一下即可；
② 進行反應體系配制的房間，與樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間建議分開。
3.PCR 參數設置

4.PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳
　　配制含溴化乙錠（EB）的濃度為 1.5%的 DNA 瓊脂糖凝膠（推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號：AN34L047，該產品預添加了無毒安全染料）；當溴酚藍染料跑出上樣孔 3-4 cm時，停止電泳，拍照。
5.結果判斷  
PCR 擴增的結果有可能出現以下幾種情況：

　　支原體 PCR 擴增結果：586 bp 條帶為內參條帶，270 bp 左右的條帶為支原體特異條帶（各支原體的條帶大小會略有不同，總體在 266-280 bp 之間。注意：支原體特異條帶的大小不會超過該范圍。超過該范圍的，就是雜帶?。?。隨著支原體 DNA 模板的增加，270 bp 左右的條帶會逐漸增強而 586 bp 的內參條帶會逐漸減弱，甚至消失。
　　泳道1：陰性對照或者沒有支原體污染的樣品；
　　泳道2：極重度支原體污染樣品；
　　泳道3：重度污染樣品；
　　泳道4：中度污染樣品；
　　泳道5：輕度污染樣品；
　　泳道6：PCR 的擴增被細胞的代謝產物抑制，導致擴增失敗。
　　M：DNA marker.
注意事項
1.設有陰性對照，保證本試劑盒含有的支原體引物和內參以及整個反應體系正常。
2.只有當陰性對照的結果沒有出現 270 bp 左右的支原體特異條帶時，其他樣品的檢測結果才是可信的。
3.每次試驗陰性對照中 586 bp 的內參條帶都必須出現而且要有一定的亮度，才說明試驗成功。如果陰性對照的內參條帶經常沒有出現或者非常弱，說明試驗不成功，這時可以采取以下幾個措施： a.請使用普通蒸餾水或去離子水。不能使用去內毒素的水、DEPC 處理的水或者商品化的 DNase/RNase-free的水，這幾種水都可能會抑制 PCR 擴增的效率。 b.請使用 Takara 公司的 Ex Taq Hot Start version（推薦。貨號： RR006A，可用 400 次）。 c.可以嘗試增加 PCR 的循環數，比如：由原來的 40 個循環，增加到 45 個循環。如果采取以上幾個措施后，陰性對照的內參條帶仍然經常沒有出現或者非常弱，請聯系廠家解決。
4.如果直接使用細胞培養液上清進行檢測，而檢測結果顯示該樣品 586 bp 條帶和 270 bp 左右的條帶都沒有出現（如圖 1，泳道 6）或者內參條帶非常微弱，在排除 PCR試劑的問題后,說明該樣品含有抑制 PCR 擴增的代謝產物。
5.防 DNA 污染注意事項： a.強烈建議所有操作全部使用進口濾芯吸頭（比如：Axygen 濾芯吸頭）進行操作，以免試劑被污染。 b.“PCR 體系配制的房間、移液槍"（不要使用細胞培養室的移液槍?。┖汀癙CR 產物的電泳房間、移液槍"一定要分開，不能在同一個房間進行，也不能使用相同的移液槍進行操作。 c.PCR 產物是導致假陽性的主要原因，PCR 產物不要在 PCR 體系配制的房間中打開。 d.樣品處理的房間和移液槍，如有條件，建議也分開。 e.收到的支原體引物和內參，可以分裝（比如 40 μL一支）后保存。
6.如發現細胞被支原體污染，推薦使用李記生物的Quick Cell支原體祛除預防試劑盒，貨號：AC16L066；以及EZ 水浴鍋抑菌劑，貨號：AC16L162 和 EZ 細胞房除菌劑，貨號：AC16L143。產品詳情可咨詢銷售人員或見李記生物網站。
7.支原體檢測樣品可以分成兩類：①用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達 10^7-9/mL，可以直接檢測。②低溫保存的血漿、血清、臍帶血、*酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮處理；（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含jing氨酸和含jing氨酸的兩種支原體液體培養基）培養 3-7 d后，再進行檢測。具體方法請參考李記生物 Quick Cell 發光法支原體檢測試劑盒，貨號：AC16L062 說明書中后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要 3-7 d，但是可靠性高。
8.該產品主要用于細胞上清支原體污染檢測，僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。
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